先天性巨结肠其诊断主要依靠两种手段:第一是影像诊断。经肛门注射钡剂后，可做钡剂灌肠，观察肠段是否有明显扩张；另一种方法，即定性方法，是切除部分肠壁组织进行病理检查，观察肠组织是否缺少神经细胞。如果没有神经细胞，就可以得到明确的诊断。这种方法是诊断先天性巨结肠的必要和非常重要的手段。